紅陽獼猴桃高效再生體系的建立及抗病基因LJAMP2的導(dǎo)入
周月
【摘要】：獼猴桃營養(yǎng)豐富,風(fēng)味獨(dú)特,被譽(yù)為“水果之王”?！t陽’獼猴桃果肉黃綠色,橫截面具放射狀血紅色條紋,含糖量高于其它獼猴桃品種,果汁鮮美,商品價(jià)值高。但獼猴桃屬雌雄異株植物,倍性復(fù)雜,雌雄株間花期不遇，致使種間雜交困難,育種周期長,具有不確定性。采用播種等常規(guī)繁殖方式容易造成品種退化,而利用組織培養(yǎng)方法可保持良種遺傳性狀和實(shí)現(xiàn)大量繁殖。近年來,國內(nèi)主要對中華獼猴桃,國外主要對美味獼猴桃進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究,但繁殖效率普遍較低,且對紅陽獼猴桃的研究太少。因此,在獼猴桃育種中,迫切要求采用新的技術(shù)與手段改變其傳統(tǒng)育種現(xiàn)狀。同時(shí),獼猴桃包括紅陽獼猴桃在生產(chǎn)栽培中易遭受病蟲害。在諸多病害中,潰瘍病最為突出,而傳統(tǒng)生產(chǎn)中農(nóng)藥的使用會(huì)帶來很多副作用。植物基因工程技術(shù)為獼猴桃的抗病育種提供了一條新途徑。 本研究以紅陽獼猴桃莖段和葉片為外植體,通過莖段不定芽誘導(dǎo)與增殖和生根等培養(yǎng)基的篩選,通過葉片直接再生和不定芽增殖培養(yǎng)基的篩選以及良好根系的誘導(dǎo)形成建立了高頻再生體系,為紅陽獼猴桃的抗病基因工程育種奠定了良好基礎(chǔ)。通過影響轉(zhuǎn)化頻率的諸因素水平篩選,建立了遺傳轉(zhuǎn)化體系。經(jīng)GUS染色和PCR分析,初步證明外源抗病基因LJAMP2已成功整合到紅陽獼猴桃基因組中。 主要研究結(jié)果如下： 1.莖段高效再生體系的建立。結(jié)果表明,最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA,莖段外植體培養(yǎng)30d，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%：最佳愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+2.0mg·L-12,4-D+0.4mg·L-16-BA,愈傷組織培養(yǎng)20d,1～4代平均增殖系數(shù)為3.38(倍)；最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+5.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA,愈傷組織培養(yǎng)60d,不定芽誘導(dǎo)率達(dá)83.33%,每塊愈傷平均出芽數(shù)7.5個(gè)。最佳不定芽繼代培養(yǎng)基為MS+3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA,不定芽培養(yǎng)20d,1～6代平均繁殖系數(shù)達(dá)6.78；不定芽經(jīng)0.01%IBA處理40min,在1/2MS培養(yǎng)基中20d生根率達(dá)100%,試管苗在含1/2MS液體培養(yǎng)基的珍珠巖中培養(yǎng)20d,根系發(fā)育良好。抽取85株試管苗移栽到田間營養(yǎng)缽中，15d后成活81株,成活率達(dá)95.29%。 2.葉片直接高效再生體系的建立。結(jié)果表明,最佳直接出芽培養(yǎng)基為MS+3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA,葉片外植體培養(yǎng)40d,不定芽誘導(dǎo)率達(dá)100%,平均出芽數(shù)18.67個(gè)/葉盤；在MS+2.0mg·L-1BA+1.0mg·L-1NAA+0.1mg·L-1GA3培養(yǎng)基中,30d增殖率達(dá)100%,1-6代不定芽平均繁殖系數(shù)達(dá)8.63；適宜壯苗培養(yǎng)基為MS+0.4mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA,不定芽伸長生長迅速；伸長后的不定芽在含0.8mg·L-1IBA的1/2MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根15d后,在1/2MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d(共生根30d),生根率達(dá)100%,根系發(fā)育良好。98株試管苗移栽到田間土營養(yǎng)缽中,30d成活95株,成活率達(dá)96.94%。 3.卡那霉素(Kan)選擇壓、抑菌抗生素及其濃度的確定。以葉片直接再生體系為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),研究了不同抗生素對外植體生長的影響。結(jié)果表明,不定芽分化受高濃度Kan抑制。培養(yǎng)基中不含Kan時(shí),外植體分化正常；含15mg·L-1Kan時(shí),葉片形成少量愈傷組織(愈傷形成率8.56%),但沒有不定芽分化;含20mg·L-1Kan時(shí),愈傷組織形成和不定芽分化完全被抑制,外植體顏色逐漸變淺直至發(fā)白、死亡；含30mg·L-1Kan時(shí),葉片完全褐化、死亡。因此,Kan選擇壓(臨界濃度)確定為20mg·L-1。100～500mg·L-1頭孢霉素(Cef)不能抑制農(nóng)桿菌生長,400mg·L-1羧芐青霉素(Carb)能很好抑制農(nóng)桿菌生長,且在最佳直接出芽培養(yǎng)基中,不定芽再生率達(dá)100%。因此,適宜的抑菌抗生素為Carb,其使用濃度為400mg·L-1。 4.影響轉(zhuǎn)化頻率的其它因素最佳水平的確定。以葉片為外植體,研究了影響轉(zhuǎn)化頻率的諸因素最佳水平。結(jié)果表明,諸因素的最佳水平分別為：預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d、農(nóng)桿菌浸染濃度為OD600=0.5,菌液中乙酸丁香酮(AS)含量為100μmol·L-1,浸染時(shí)間為10min,共培養(yǎng)為48h。 5.轉(zhuǎn)基因植株的獲得。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,轉(zhuǎn)化來源于益母草的陽離子抗菌肽基因LJAMP2。經(jīng)Kanr篩選,共獲得40株Kanr植株,經(jīng)GUS組織染色和PCR檢測,23株Kanr植株呈陽性,陽性植株達(dá)57.50%,證明外源基因LJAMP2已成功整合到紅陽獼猴桃基因組中。
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（獼猴桃雄株花粉價(jià)格）
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