已證實獼猴桃花粉是潰瘍病遠距離傳播的主要途徑之一。研究60Co-γ輻照、臭氧、紫外、微波、梯度水?。?5、50、80、100 ℃）等5種物理滅菌方法，ClO2、乙蒜素、四霉素、春雷霉素、氧化亞銅、代森銨、中生菌素和納米銀等8種化學藥劑殺菌方法，對獼猴桃花粉潰瘍病菌殺滅率、花粉活力、坐果率、單果質量和果實品質的影響。
▲獼猴桃生產上大量使用人工輔助授粉
結果表明，紫外、微波、水浴和乙蒜素、四霉素、春雷霉素、代森銨處理的殺菌率較低，且花粉活力顯著降低；60Co-γ輻照和ClO2、中生菌素、納米銀及氧化亞銅雖可保證有效的殺菌率及花粉活力，但會造成授粉后坐果率、單果質量、大小、硬度、可溶性固形物、干物質、維生素C含量、可溶性糖及可滴定酸等顯著下降；
642.85mg·m-3臭氧1h的花粉滅菌效果最佳，滅菌率達99.52%，花粉活力僅下降2.92%；坐果率、果實硬度、維生素C含量、可溶性糖、可滴定酸、果實單果質量、大小、干物質及可溶性固形物變化不大。結合成本、可操作性及環(huán)保等多因素考慮，臭氧處理是其中最有效且安全的獼猴桃花粉滅菌方法。
▲中科院湖北武漢植物園國家獼猴桃種質量資源圃
獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）是20世紀由野生到商業(yè)栽培最成功的植物馴化范例之一。中國是獼猴桃屬植物的原產地和獼猴桃栽培品種的發(fā)源地，據聯合國糧農組織（FAO）的數據，至2019年12月，中國獼猴桃總結果面積已占全球總結果面積的 67.92%，成為世界最大的獼猴桃生產國。
▲中國獼猴桃總結果面積已占全球總結果面積的 67.92%
自2007年以來，丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的獼猴桃細菌性潰瘍病在世界范圍內大面積爆發(fā)，嚴重危害了世界獼猴桃產業(yè)的健康發(fā)展（李黎等，2013；Pereira et al.，2021）。獼猴桃為功能性雌雄異株，其花粉特性對坐果率、果肉顏色、果實大小、品質、產量等具有決定性作用（齊秀娟等，2016）。近年來已證實帶菌花粉為獼猴桃潰瘍病大范圍遠距離傳播的主要途徑之一，在新西蘭、意大利、智利及阿根廷的獼猴桃花粉中均檢測到潰瘍病菌（Vanneste et al.，2011；Tontou et al.，2014；Balestra et al.，2018；Kim et al.，2018）。
（中科院湖北武漢植物園）
本團隊調查發(fā)現中國部分果園不按雌雄配比栽培雄株，甚至不栽植雄株，采用未經滅菌的花粉人工授粉，加速了潰瘍病傳播（鐘彩虹等，2020）。盡快建立既能殺滅花粉中Psa病菌又能保持花粉活力，且對果實產量品質無顯著影響的滅菌方法，對防止獼猴桃潰瘍病菌通過花粉快速傳播，降低其對獼猴桃產業(yè)造成的經濟損失具有重要的指導意義。本研究在前期展開的潰瘍病菌最佳防治藥劑評價工作的基礎上，比較分析了60Co-γ輻照、臭氧、紫外、微波、梯度水浴（35、50、80、100 ℃）等5種物理滅菌方法，和ClO2、乙蒜素、四霉素、春雷霉素、氧化亞銅、45%代森銨、中生菌素、納米銀等8種化學藥劑殺菌方法，對花粉潰瘍病菌殺滅率、花粉活力及坐果、產量、品質的影響，擬通過系統(tǒng)比較分析，建立高效、綠色、環(huán)保的獼猴桃花粉滅菌技術體系。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
1 材料與方法
1.1 試驗材料
供試獼猴桃潰瘍病菌菌株2個，其中C30菌株分離自四川省都江堰市虹口鄉(xiāng)，C48菌株分離自湖南省常德市東山峰農場（Honour et al.，2017）。供試獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）花粉（2019 年采集）由陜西佰瑞獼猴桃研究院有限公司惠贈。2019年9-12月，在中國科學院武漢植物園獼猴桃組病理實驗室完成室內花粉滅菌率及活力分析；2020年4月，在湖北廣水、赤壁及武漢的獼猴桃實驗基地完成田間授粉試驗；2020 年9-10月，在中國科學院武漢植物園獼猴桃組采后實驗室完成果實品質檢測。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
1.2 試驗方法
1.2.1 Psa病原菌培養(yǎng)及花粉染菌
將C30菌株和C48菌株在KB 固體培養(yǎng)基（20克蛋白胨、1.5克MgSO4·7H2O、10毫升甘油、15克瓊脂粉定容至1升，121℃高壓滅菌 30min）上劃線培養(yǎng)，在24℃、相對濕度為70%條件下培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種在10mmol ? L? MgSO4無菌溶液中，恒溫振蕩培養(yǎng)12小時，稀釋菌懸液濃度至106cfu · mL-1。準確稱取10克 獼猴桃花粉，將10毫升濃度為106cfu · mL-1的 Psa菌懸液均勻噴濕在花粉上，自然晾干，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
▲中科院湖北武漢植物園國家獼猴桃種質量資源圃
1.2.2 物理方法滅菌
60Co-γ射線輻照：分別取染菌和無菌花粉各21克，分為21份，每份1克，置于滅菌玻璃瓶中密封，隨后在輻照裝置上動態(tài)連續(xù)輻照。放射源為 60Co，放射性活度為3.7×1010Bq，設定7個劑量（表1）。試驗在常溫條件下進行，由湖北省農業(yè)科學院核農加工研究所協助完成。
臭氧：稱取染菌和無菌花粉各18g，分為18份，每份1g，平鋪在稱量紙上，置于流通臭氧的透明塑料盒中，設定3個臭氧濃度和2個作用時間（表 1），共6個處理。
紫外線：稱取染菌和無菌花粉各3g，分為3份，每份1g，平鋪在稱量紙上，置于超凈工作臺中強度20W的紫外燈下培養(yǎng)24h，樣本與燈管之間距離50cm。
微波加熱：稱取染菌和無菌花粉各3g，分為3份，每份1g，置于滅菌燒杯中，700W微波處理90秒后翻動花粉散熱2分鐘。
梯度水?。夯贓vreett等（2012）的方法，每處理稱取染菌和無菌花粉1g，分別置于滅菌燒杯中 35、50、80、100℃水浴培養(yǎng)，水浴時間見表 1。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
1.2.3 化學方法滅菌
供試化學藥劑共8種，包含ClO2、乙蒜素、四霉素、春雷霉素、氧化亞銅、45%代森銨、中生菌素及納米銀溶液（表2）。準確稱取染菌花粉0.1g，置于100mLKB液體培養(yǎng)基（20g蛋白胨、1.5g MgSO4·7H2O、10mL甘油定容至 1L，121 ℃高壓滅菌30 min）中，24℃、200r · min-1過夜培養(yǎng)12小時，稀釋菌懸液濃度至 106cfu·mL-1。分別吸取菌懸液 1mL 加入 4mL 供試化學試劑中，充分混勻，作用時間梯度設定為15、30、45、60 min，以無菌水為空白對照。
▲高活性獼猴桃花粉
1.2.4 不同滅菌方法的抑菌率分析及對花粉活力影響
物理方法處理后，分別取 0.5g花粉于500μL 10 mmol?L-1 MgSO4 溶液中，45Hz 研磨120s后稀釋涂板，24℃培養(yǎng)48h，用菌落計數法進行計數。化學方法處理后，吸取菌懸液和試劑混合樣本100μL進行稀釋涂板，24℃培養(yǎng)48h，用菌落計數法進行計數。以未處理染菌花粉作對照。對2個菌株，分別設置 6 個涂板重復。滅菌率（%）=（對照菌落數–處理菌落數）/對照菌落數×100。
用離體萌發(fā)法進行活力測試。在載玻片上涂薄薄一層培養(yǎng)液（10g蔗糖，0.8g瓊脂，1mL硼酸，加雙蒸水至100mL）作為發(fā)芽床。對物理方法處理的樣本，用牙簽將花粉輕輕撒在載玻片上；對化學方法處理樣本，取10μL花粉懸液于載玻片上。在培養(yǎng)皿中鋪上一片濾紙，用無菌水浸濕。將載玻片放入培養(yǎng)皿中加蓋玻片，20~25℃放置24小時在10倍顯微鏡下觀察，以花粉管長度≥花粉直徑的一半視為萌發(fā)。各樣本取3個視野，每個視野的總花粉數不少于100個，以未處理花粉為對照（楊紅等，2015）?；ǚ刍盍Γ?）=萌發(fā)花粉粒數/觀察花粉粒數×100。
▲播宏獼猴桃花粉
1.2.5 田間驗證試驗
選取效果較好的6種處理方法（表3）進行田間驗證試驗。在湖北廣水、赤壁和武漢各選1個獼猴桃園為試驗地，選取健康、無病害、樹勢相近的‘翠玉’品種植株32株，4株為1個試驗組。
授粉前將所有雌花在大蕾期（4月15—17日）進行套袋。盛花期（4月22—26日）晴天清晨解開套袋并進行人工授粉，然后立即再套袋。待獼猴桃花瓣自然脫落后除袋。將未經處理或用無菌水處理的花粉分別作為物理和化學方法對照。將物理方法處理后的花粉與輔料按1︰5混合均勻后點授。將化學方法處理后的花粉進行中和（中和劑，0.5g 硫代硫酸鈉、2.0mL 吐溫 80）后立即液體授粉（曹凡等，2018），授粉溶液現配現用（超過2小時花粉會逐漸失去活力影響授粉效果）。為保證授粉的一致性，每朵雌花只授粉 1 次。
授粉結束10天內（4月28日—5月6日）調查各樹坐果率。坐果率（%）= 坐果數/授粉花朵數×100。9月下旬果實成熟期（24—28日）隨機采果，每個果園每個處理各60個果實。采摘當天檢測30個果實的單果質量、果實大?。v徑、橫徑、側徑）、硬度、干物質及可溶性固形物；其他30個果實置于室溫條件下放至微軟熟（硬度降至 1kgf以下），采用果蔬硬度計測定果實硬度；采用折光儀測定可溶性固形物含量；采用2,6–二氯靛酚法測定維生素C含量；采用DNS方法測定可溶性糖含量；采用氫氧化鈉滴定法測定可滴定酸含量（黃文俊等，2020；國標NY/T2742-2015）。
▲獼猴桃花粉滅菌方法滅菌率及對花粉活性的影響
2 結果與分析
2.1 物理處理對花粉潰瘍病菌的殺滅率和花粉活力影響整體上，隨著處理強度增加或時間延長，Psa 殺滅率增加，花粉活力降低（表1）。輻照劑量為800~1600 Gray的 60Co-γ 輻照滅菌率高于97.5%，其中1000Gray 滅菌率達99.50%，花粉活力僅下降3.50%。642.85 mg ? m-3 臭氧處理1小時 的滅菌率可達99.52%，花粉活力僅下降2.92%。其他方法效果不佳，如紫外線、微波、35℃及50℃熱處理的殺菌率均低于75%，80℃及沸水浴處理的殺菌率雖較高，但會造成花粉完全失活。因此，綜合滅菌率及花粉活力下降率分析，642.85mg·m-3臭氧1小時和1000 Gry 60Co-γ 輻射的效果最好。
▲獼猴桃花粉滅菌方法滅菌率及對花粉活性的影響
2.2 化學藥劑處理對花粉潰瘍病菌的殺滅率和花粉活力影響
由表2可知，中生菌素、ClO2 溶液及乙蒜素的殺菌率最優(yōu)，處理15min以上殺菌率均可達到98.98%~100.00%；納米銀和四霉素處理45min及60min時殺菌率可達到99.98%~100%；代森銨、氧化亞銅及春雷霉素的殺菌率相對較低。乙蒜素和代森銨處理，花粉活力大幅度降低或完全失活；其他藥劑也會造成花粉活力不同程度下降。綜合分析，3%中生菌素 800倍處理60min、0.15mmol?L-1ClO2 溶液、86.2%氧化亞銅 1000倍和0.2%納米銀溶液處理 45min效果較好，對花粉中Psa病菌的殺死率分別為100%、100%、99.10%及99.98%，花粉活力分別下降9.25%、6.25%、7.66%及 9.42%。
▲獼猴桃花粉滅菌方法比較及對果實品質的影響
2.3 滅菌花粉對獼猴桃坐果及果實品質的影響
由表3 可知，與花粉活力試驗結果正相關，在6種效果較好的處理中，除氧化亞銅外其他5種滅菌花粉的坐果率均無顯著變化。但 60Co-γ 輻射會導致果實變小，硬度、干物質及可溶性固形物含量均有不同程度的下降；臭氧處理明顯優(yōu)于60Co-γ 輻射，果實單果質量、大小、可溶性固形物、干物質與對照基本一致，僅硬度有小幅度下降。4種化學方法處理后，果實單果質量、大小、硬度指標均顯著下降，干物質及可溶性固形物含量變化不大；其中氧化亞銅處理坐果率最低，但對果實大小的影響最小。
▲獼猴桃花粉滅菌方法比較及對果實品質的影響
由表4可知，物理處理花粉對果實品質的影響不大，但維生素C含量略有下降；化學處理中ClO2與對照相比無差異，其他處理各指標有不同程度下降。相對而言，臭氧和 ClO2處理對果實軟熟指標的影響較小。
▲給獼猴桃授粉
3 討論
在潰瘍病發(fā)生前，國內外對獼猴桃花粉的研究主要在質量、活力及類型對果實性狀的影響上（李鵬，2017）。2007年以來，獼猴桃潰瘍病從意大利暴發(fā)蔓延，各國科學家開始解析該病菌的傳播途徑（Gallelli et al.，2011）。Stefani 和 Giovanardi（2011）通過溫室及田間試驗發(fā)現，運用被污染的花粉進行授粉會導致健康花朵上Psa附生，首次證實潰瘍病菌會隨花粉傳播。Braggins和Saunders（2012）檢測發(fā)現田間花藥上潰瘍病菌濃度約為1.8×107 cfu·g-1。Donati 等（2018）利用熒光及共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現 Psa病原菌可附生或內生定殖在雄花花藥上并呈點狀分布，在花粉囊裂口處也可觀察到帶菌花粉，直觀地證實了花粉是 Psa病菌遠距離傳播的主要途徑之一。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
目前對花粉進行物理滅菌研究較多，常用的方法有乙醇、濕熱、微波、輻照、紫外線殺菌等（延莎等，2020）。10000 Gry 的 60Co-γ 輻照在蜂花粉的滅菌中效果較好，能有效殺滅微生物，且對營養(yǎng)成分沒有明顯影響，不存在放射性殘留問題（羅志平等，2015）；功率10kW、傳送頻率10Hz、物料厚度 1.0cm及14min的微波處理，結合30℃、60%相對濕度、8h的干燥加熱工藝為松花粉的最佳滅菌處理條件（李海龍等，2015）。針對獼猴桃花粉，新西蘭 Everett 等（2012）首次進行熱處理滅菌研究，發(fā)現短時間的高溫高濕有利于快速殺滅潰瘍病菌，但也會嚴重影響花粉活力，如當Psa濃度為 107cfu·mL-1時，55℃及 50%濕度條件下處理3.1min，Psa殺滅率達90%，但花粉活力下降50%；而當溫度不變，濕度降低時，花粉活力下降變緩，但是 Psa生存時間也隨之延長；最終確定35℃、30%濕度條件下處理20h或以上，能有效去除 Psa且對花粉活力影響較小。曹凡（2018）分析了不同濃度的臭氧對獼猴桃花粉的影響，發(fā)現在濃度為 600mg·m-3 的條件下處理30min，潰瘍病菌的殺菌率可達90.77%，花粉活力下降9.66%，果實坐果率、總質量、單果質量和種子數分別下降7.56%、0.76%、0.76%和 8.9%，適宜獼猴桃花粉滅菌。
▲貴州獼猴桃花粉
本研究中在驗證熱處理及臭氧方法的滅菌率及花粉活力情況的同時，選用了前期在花粉滅菌研究方面報道較好的 5種物理滅菌方法進行對比分析，并增加了對果實的品質分析。結果表明紫外線、微波、35℃和 50℃熱處理的殺菌率均低于 75%，與 Everett等（2012）的報道存在一定差異；80 ℃和 100℃處理的殺菌率較高，但會造成花粉完全失活；同時發(fā)現濃度為642.85mg·m-3的臭氧處理1 h 滅菌率高達99.52%，花粉活力僅下降2.92%；1000 Gray的60Co-γ 輻照滅菌率達99.50%，花粉活力僅下降3.50%。相較而言，60Co-γ 輻照需要在專業(yè)機構完成，花粉來回運輸可能會造成活力降低；臭氧處理成本低，易操作，在與氧氣的轉化過程中沒有二次殘留及二次污染物產生，相對綠色環(huán)保，優(yōu)勢明顯。臭氧處理后坐果率、單果質量、果實大小、可溶性固形物、干物質含量變化不大，僅硬度稍微下降；而軟熟階段僅維生素C含量有所下降。本研究的結果與曹凡（2018）的基本一致，并進一步證實了臭氧處理可有效維持果實的品質。
在化學處理方面，曹凡等（2018）分析發(fā)現10mg·L-1 ClO2 溶液處理 45min，滅菌率高于99%，活力下降0.5%，坐果率下降12%，對果實總產量、單果質量均無明顯影響。本研究中對 8 種化學藥劑對獼猴桃花粉的滅菌率及活力影響進行了對比分析，發(fā)現 3%中生菌素800× 處理 60min、0.15mmol?L-1 ClO2 溶液、86.2%氧化亞銅 1000×及0.2%納米銀溶液分別處理 45min的花粉中 Psa病菌的殺死率均接近100%，花粉活力下降值介于6.25%~9.42%之間。進一步研究結果表明化學處理均會造成坐果率、果實大小、下樹及軟熟期間的可溶性固形物、維生素C、可溶性糖及可滴定酸指標不同程度的降低。由于目前液體授粉操作較為繁瑣，在獼猴桃產業(yè)中的應用率仍不高，且前期研究證實潰瘍病菌更易通過液體授粉傳播（Stefani & Giovanardi，2011），因此從應用前景來看，臭氧物理處理優(yōu)于化學藥劑處理。
▲播宏公司位于貴州遵義的獼猴桃花粉采摘園，國內唯一全部自有種植基地生產的獼猴桃花粉
此外，不論物理或化學方法處理，大部分處理劑量升高和時間延長會使 Psa 的殺滅率逐漸增加，花粉活力逐漸下降。但部分處理中會出現波動，如 60Co-γ、臭氧、50℃水浴、中生菌素、四霉素、氧化亞銅及納米銀處理。Everett等（2012）發(fā)現 Psa 滅菌率及花粉活力在不同溫度、濕度條件下的回歸方程完全不同，部分處理的滅菌率會呈現倒U形，原因可能與花粉和病菌的耐熱、耐濕機理有關。曹凡等（2018）發(fā)現0.10 mg·L-1噻霉酮處理花粉 15~60min，Psa殺滅率隨時間延長出現了先降后升的趨勢；使用同一濃度的 ClO2處理花粉后，處理前30min花粉活力逐漸下降，但處理后期花粉活力呈上升趨勢，可能與不同藥劑的化學特性有關，有待進一步深入研究。綜上，結合各處理對花粉的滅菌率、活力及果實品質等多項指標的影響、經濟實用性及可操作性考慮，認為臭氧技術處理花粉最適合目前獼猴桃產業(yè)的發(fā)展。此外，近年多項研究證實臭氧處理可顯著降低由灰葡萄孢霉和擴展青霉菌引起的病害發(fā)病率，維持果實較高的硬度、可溶性固形物、可滴定酸和維生素C含量，延緩貯藏過程中果實乙烯釋放，提升抗性酶活性，延緩果實后熟衰老。由此可見，臭氧在獼猴桃產業(yè)的采后病害及貯藏方面也具有良好的應用前景。本團隊將進一步針對獼猴桃花粉及果實的臭氧處理工藝及裝置進行設計改良，希望研究結果能盡快服務于獼猴桃產業(yè)。
本文發(fā)表于園藝學報, 2022, 49 作者：李黎 馮丹丹 潘慧 李文藝 鄧蕾 汪祖鵬 鐘彩虹
公司有紅心獼猴桃采摘園、獼猴桃苗圃、獼猴桃花粉園，其中獼猴桃花粉項目是中國單體面積最大的獼猴桃花粉園，單個采粉園達到了400畝，豐產期產花粉200公斤，可以滿足15000畝果園的花粉需要。公司主要致力于獼猴桃生產、銷售、批發(fā)、零售、團購，獼猴桃苗木以及獼猴桃雄株園管理。 引進人才進行技術指導，倡導給中國獼猴桃果園使用當年新鮮的花粉。
2024年新鮮獼猴桃花粉即將上市，大量現貨，現在下手價格最實惠。紅心獼猴桃批發(fā)熱線電話18080805514 18030405084
紅心獼猴桃“雄花粉”到底貴不貴？采集花粉和人工授粉的注意事項
初學者如何區(qū)分紅心獼猴桃公樹母樹（雄株雌株）掌握這幾點事就不難了
逆境中尋出路 貴州遵義三岔鎮(zhèn)獼猴桃小花粉 做出新產業(yè)
2019.10.23中央電視臺農業(yè)農村頻道播出我們公司在貴州山區(qū)種植獼猴桃創(chuàng)業(yè)者的故事
關鍵詞: 獼猴桃, 潰瘍病, 花粉, 滅菌方法, 滅菌率, 活力, 果實品質
Abstract:
Pollen has been proved to be one of the main pathways for long-distance transmission of kiwifruit bacterial canker（Pseudomonas syringae pv. actinidiae,Psa）. Five physical sterilize methods including 60Co-γ irradiation,ozone,UV,microwave,water-bath heating（35,50,80,100 ℃）,and eight chemical sterilize methods including? ClO2，ethylicin，tetramycin，kasugamycin，cuprous oxide，amobam，zhongshengmycin and sliver nanoparticles were applied to analyze the effect to kiwifruit pollen. The index of Psa sterilization rate,pollen viability,fruit setting rate,single fruit weight and fruit quality were analyzed. The results showed that the sterilization rate and pollen viability of partial treatments are relatively low,such as UV,microwave,water-bath heating，ethylicin，tetramycin，kasugamycin and amobam solution。Other treatments caused the index including fruit setting rate,single fruit weight,size,fruit firmness,soluble solids,dry matter,vitamin C,soluble sugar and titratable acid content decreased significantly，such as 60Co-γ irradiation，ClO2,cuprous oxide，Zhongshengmycin and sliver nanoparticles.
(獼猴桃花粉)
The optimum disinfection method is ozone with concentration of 642.85 mg · m-3 for 1 h,the Psa sterilization rate reached 99.52% while the decline rate of pollen viability was merely declined 2.92%. The fruit setting rate,fruit firmness,vitamin C,soluble sugar and titratable acid,single fruit weight,size,dry matter and soluble solids index decreased slightly without significant difference. Comprehensive analysis the cost,operability and environmental protection factors,ozone technology can be regarded as the most effective and safe method for kiwifruit pollen sterilization.
Key words: kiwifruit, bacterial canker, pollen, sterilization method, sterilization rate, viability, fruit quality
(獼猴桃花粉授粉)
(獼猴桃授粉)
(獼猴桃蜜蜂授粉)
評論