不同美味獼猴桃花粉萌發(fā)活力及形態(tài)學研究
摘要：為探究獼猴桃花粉萌發(fā)活力和花粉萌發(fā)前后的形態(tài)變化，以 15 份美味獼猴桃花粉為樣本，采用離體培養(yǎng)方法測定花粉的萌發(fā)活力，利用掃描電鏡觀察離體培養(yǎng)前后 5 份雌株花粉和 10 份雄株花粉的形態(tài)變化。 結果表明：15 份花粉樣本萌發(fā)率差異較大，5 份雌株花粉均不萌發(fā)；10 份雄株花粉中 8 號花粉樣本的萌發(fā)率最高，為27%；9 號花粉樣本的萌發(fā)率最低,僅為22. 85%。15份花粉樣本離體培養(yǎng)前后掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：極面觀基本相同，均為三裂圓形：赤道面觀有差異，5 份雌株花粉離體培養(yǎng)前后花粉形態(tài)不發(fā)生改變,均為近球形，而 10 份雄株花粉在萌發(fā)前為超長球形或長球形，萌發(fā)后均為近球形，極軸長度略有變小、赤道軸長變大、極軸長度與赤道軸長度比值變小、萌發(fā)溝寬度增寬,但萌發(fā)后的雄株花粉樣本間各項形態(tài)學指標值差異較小。
關鍵詞
獼猴桃; 花粉; 離體培養(yǎng); 萌發(fā)活力; 形態(tài)學
▲picking kiwi flowers
Abstract
In order to investigate the viability of kiwifruit pollen，and to study the morphological changes before and after pollen germination, 15 samples of Actinidia deliciosa pollens were used in this experiment. An in vitro culture method was used to determine pollen germination viability, and scanning electron microscopy was used to observe the morphology of five female pollens and ten male pollens before and after germination. The results showed that the germination rate of pollens from male plants varied considerably.
▲picking kiwi flowers
None of the five female pollens germinated. Among the 10 male pollen samples No. 8 had the highest germination rate of 79.27% and No. 9 had the lowest germination rate of 22.85% . The polar facial view of the 15 samples did not change before and after ex vivo incubation. These samples were all trilobate circles. However, there was a significant difference in their equatorial view. The pollen morphology did not change before and after the female plants were cultured in isolation, and they were all spheroidal. The pollens of the male plant were perprolate or prolate before germination, and after germination in culture in vitro，all 10 samples were sub-spherical，with the polar axis length becoming almost smaller, the equatorial axis length becoming larger, the P/E ratio becoming smaller, and the?width of the germination groove becoming larger. The differences in the values of the morphological indexes between the samples were small.
Keywords kiwifruit； pollen； in vitro incubation; germination vigor; morphology
▲獼猴桃花粉萌發(fā)情況
獼猴桃是獼猴桃科( Actinidiaceae) 獼猴桃屬( Actinidia)的一種優(yōu)質水果，因其營養(yǎng)豐富、口感獨特,深受消費者的喜愛，已成為世界消費量最大的水果之一。 獼猴桃原產于中國，而世界獼猴桃產業(yè)的發(fā)展卻起始于新西蘭 20世紀 30年代馴化的美味獼猴桃，雖然我國獼猴桃產業(yè)起步晚，但是經過幾十年的發(fā)展，現(xiàn)已成為世界上獼猴桃產業(yè)發(fā)展規(guī)模最大的國家。獼猴桃是一種雌雄異株植物，其花朵是形態(tài)上的二性花，在功能上一般為單性花，通常表現(xiàn)為雄株的花粉可育，雌株的花粉敗育，在個體表現(xiàn)上分為雌株和雄株。 目前，獼猴桃主要的栽培品種為中華獼猴桃原變種(A. chinensis var. chinensis)和美味獼猴桃變種( A.chinensis var. deliciosa)，大多是通過傳統(tǒng)的雜交育種和實生選種而來的雌株和雄株品種。在生產中，選擇優(yōu)質的雄株花粉可大幅度提高授粉的成功率，花粉活力的高低是雄株花粉優(yōu)質與否的重要指標?，F(xiàn)有花粉活力的測定多選用離體培養(yǎng)的方法觀察獼猴桃花粉萌發(fā)情況，該方法可以直觀有效地定量判定不同花粉活力的高低。關于獼猴桃花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)，相關學者進行了萌發(fā)過程中蔗糖、硼酸等因子的影響、最佳萌發(fā)環(huán)境條件、花粉采集時期和貯藏條件、散粉規(guī)律等方面的研究，但是對花粉萌發(fā)前后的形態(tài)變化的研究鮮有報道。
▲恒溫震蕩氣育培養(yǎng)箱檢測獼猴桃花粉活性
花粉形態(tài)穩(wěn)定且攜帶大量遺傳信息，花粉形態(tài)上的差異可進行種間和種內植物的分類研究，已在黃精屬(Polygonatum)、秋海棠屬(Begonia)、薔薇花屬月季組(R. sect, chinenses)和楊梅屬(Maesa)等植物中得到運用,具有積極的參考價值?；ǚ鄣拿劝l(fā)過程極其復雜，涉及形態(tài)學多項指標的變化，雌雄株花粉在離體培養(yǎng)萌發(fā)前后形態(tài)變化的相關情況未見報道，為此，本試驗以美味獼猴桃花粉為材料，采用離體培養(yǎng)的方法測定不同來源花粉的萌發(fā)活力，以期篩選優(yōu)質的雄株花粉，利用掃描電鏡對不同花粉萌發(fā)前后的形態(tài)進行觀察研究，分析獼猴桃花粉萌發(fā)過程的形態(tài)變化差異，探究花粉萌發(fā)的復雜過程，旨為獼猴桃育種及人工授粉提供參考依據。
▲開始培養(yǎng)獼猴桃花粉，準備檢測
1
材料與方法
1.1
材料
供試花粉均來源于四川省德陽市什邡市的獼猴桃科研基地，園區(qū)土壤為黃壤土，中等肥力，未疏花、疏蕾，常規(guī)生產技術統(tǒng)一管理。2022年至2023年春季花期選取不同美味獼猴桃的健康植株進行花粉取樣，樣本具體信息見表 1。
1.2 方法
1.2.1 花粉收集
采摘不同美味獼猴桃的大蕾期花朵，用鑷子輕柔地將花藥取出,再將收集的花藥于25 ℃恒溫烘干24小時，待花粉粒爆出后，將花粉收集于棕色玻璃瓶中，密封保藏于-20 ℃冰箱中備用。
▲Collect kiwi blossoms
1.2.2 花粉活力測定
花粉活力用花粉萌發(fā)率表示,使用離體培養(yǎng)法測
定不同獼猴桃花粉的萌發(fā)率。 固體培養(yǎng)基配制：蔗糖+硼酸+瓊脂，pH 為6.5。 將各花粉樣本均勻分撒在培養(yǎng)基表面，25℃恒溫培養(yǎng)2h，使用光學顯微鏡Leica X1進行花粉萌發(fā)情況觀察和拍照，每個樣本選取 6個視野，花粉粒的數(shù)量在每個視野中不少于50個，花粉管的長度長于花粉直徑，則視為萌發(fā)，萌發(fā)率計算公式：
萌發(fā)率=( 視野中花粉萌發(fā)數(shù)/視野中花粉總數(shù))×100% 。分別統(tǒng)計供試花粉的萌發(fā)率,比較不同美味獼猴桃花粉萌發(fā)的差異。
▲正常采摘獼猴桃花蕾
1.2.3
花粉萌發(fā)前后的形態(tài)觀察
萌發(fā)前的花粉形態(tài)觀察方法：用潔凈棉簽將供試花粉輕柔地粘在導電膠上，噴金鍍膜花粉表面 1min后,用日立 SU3500掃描電鏡進行形態(tài)學觀察，選取視野拍照,隨機選取 20粒發(fā)育正常的花粉,使用 Image J軟件和 Excel 軟件測量并計算出花粉的萌發(fā)溝寬度、極軸長度(P)、赤道軸長度(E)、極軸長度與赤道軸長度比值(P/E)共計 4項指標。
▲剛采摘的獼猴桃公花，拿回去開始制花粉了
萌發(fā)后的花粉形態(tài)觀察方法：用刀片劃取帶萌發(fā)花粉的培養(yǎng)基，放置在日立 SU3500掃描電鏡的冷凍載物臺上，在-25 ℃的條件下真空冷凍觀察花粉萌發(fā)后的形態(tài)并拍照,隨機選取 20粒萌發(fā)正常的花粉，使用 Image J軟件和 Excel 軟件測量并計算出花粉的萌發(fā)溝寬度、萌發(fā)管寬度、極軸長度(P)、赤道軸長度(E)、極軸長度與赤道軸長度比值(P/E)共計 5項指標。 本試驗中涉及的花粉形狀相關分類及學術用語參考文獻。
1.3
數(shù)據分析使用 Image J 軟件測量掃描電鏡照片中的花粉形態(tài)相關數(shù)據,運用 Excel 軟件進行數(shù)據整理,統(tǒng)計分析利用 IBM SPSS Statistics 20.0 軟件進行，使用 GraphPadPrsim 9.5 軟件繪制圖形。
▲把收集好的花藥均勻的攤薄在獼猴桃花粉烘干托盤上
2
結果與分析
2.1
花粉活力測定
15 份供試花粉離體培養(yǎng) 2 h后觀察發(fā)現(xiàn)：5 份雌花花粉未長出花粉管，不萌發(fā)，無活力，不具有可育性；10份雄花花粉均長出花粉管，但是依圖 1所見，不同花粉萌發(fā)情況不同，8號樣本的萌發(fā)率最高，為79.27%，顯著高于其他 9份花粉樣本的萌發(fā)率；2 號、3 號、6 號樣本的萌發(fā)率較高，分別為71.76% 、69.64% 、67.92%，三者之間差異不顯著；10號、4號樣本的萌發(fā)率次之，分別為64.50%、61.09%，二者差異不顯著；萌發(fā)率較低的樣本是 7號、1號、5號樣本，萌發(fā)率小于50.00%；9 號樣本的萌發(fā)率為 22.85%，在所有樣本中數(shù)值最低，與其他 9份樣本差異顯著。 萌發(fā)率最高的 8號和萌發(fā)率最低的 9號之間差異很大，二者萌發(fā)率相差值為 56.42% 。
▲獼猴桃花粉活性檢測
2.2
花粉萌發(fā)前后形態(tài)學差異分析
如表 1和圖 2所示，15份花粉樣本在離體培養(yǎng)萌發(fā)前后的極面觀均為三裂圓形，而赤道面觀形態(tài)差異較大。 離體培養(yǎng)前，雌株花粉的赤道面觀為近球形，雄株花粉的赤道面觀為超長球形或長球形。 離體培養(yǎng)后，雌株花粉無花粉管長出，其赤道面觀依舊為近球形，而雄株花粉從萌發(fā)孔中長出花粉管，形態(tài)發(fā)生很大改變，其極軸長度、赤道軸長度、極軸長度與赤道軸長度的比值均發(fā)生了變化，萌發(fā)后的雄株花粉赤道面觀均變?yōu)榻蛐巍?/p>
▲獼猴桃花粉萌發(fā)情況
2.2.1 雄株花粉萌發(fā)前后極軸長度變化
如圖 3 所示，10 份雄株花粉萌發(fā)前后極軸長度明顯不同。 萌發(fā)前，7 號花粉樣本的極軸長度明顯小于其他樣本，極軸長度為(21.58±2.03) μm，其余 9份花粉樣本的極軸長度范圍在27.00~29.94μm，最大值為3 號樣本。 與萌發(fā)前相比，除7號花粉樣本萌發(fā)后極軸長度略有變長外，其余花粉樣本極軸長度均明顯變短。 萌發(fā)后，各樣本間的極軸長度差異較小，長度均值范圍在 22.13~ 24.49 μm,最大值為 3號樣本，最小值為10號樣本。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)情況
2.2.2
雄株花粉萌發(fā)前后赤道軸長度變化
如圖4 所示，10份雄株花粉萌發(fā)后的赤道軸長度明顯增長。 萌發(fā)前，所有雄株花粉樣本的赤道軸長度均小于 20μm，而且各樣本間差異較大，長度范圍在13.05~16.59μm，最小值為 1號樣本，最大值為 7號樣本；萌發(fā)后，所有樣本的赤道軸長度都明顯增長，而且長度都在 20μm以上，但各樣本間赤道軸長度差異相對較小，長度范圍在22.50~25.13μm，最小值為 4號樣本，最大值為 3號樣本。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)情況
2.2.3
雄株花粉萌發(fā)前后 P/E 比值變化
根據圖5所示，花粉萌發(fā)后，10 份雄株花粉樣本的極軸長度與赤道軸長度的比值( P/E) 均顯著降低。萌發(fā)前，10份雄株花粉樣本間的 P/E 值差異明顯，7 號花粉樣本 P/E 值最小，為(1.33±0.26) μm，與其余花粉樣本差異顯著；1 號花粉樣本 P/E 值最大，為( 2.22 ±0.24) μm。 萌發(fā)前，所有供試花粉樣本的 P/E 值均大于 1.14，表示其形狀為超長球形或長球形。萌發(fā)后，10份雄株花粉樣本間 P/E 值差異相對變小，P/E 值范圍在0.95~1.03μm，所有花粉的 P/E 值都小于1.14，表示萌發(fā)后的花粉形狀均為近球形。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)情況
2.2.4 雄株花粉萌發(fā)前后萌發(fā)溝寬度變化
如圖 6所示，10份供試雄株花粉樣本在花粉萌發(fā)后的萌發(fā)溝寬度明顯大于萌發(fā)前的寬度，且萌發(fā)前后各樣本間萌發(fā)溝寬度差異較大。 花粉萌發(fā)前，萌發(fā)溝寬度較小，寬度范圍為0.72~2.06μm，最大值為7號樣本，最小值為10號樣本。 花粉萌發(fā)后，萌發(fā)溝寬度均大大增加，寬度范圍增加到6.27~9.97μm，最大值為10號樣本，最小值為2號樣本。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)情況
2.2.5 花粉萌發(fā)后萌發(fā)管分析
從圖 7可以看出，花粉萌發(fā)后，10 份供試雄株花粉樣本間的萌發(fā)管寬度略有差異，萌發(fā)管寬度范圍在5.28~7.38μm，最大值是 6號樣本，5 號樣本次之，二者寬度均大于 7.00μm 且二者差異不顯著；最小值是 2號樣本，8 號樣本與 2 號樣本差異不顯著，二者寬度小于 6.00 μm；其余 6 份樣本寬度在 6.00 ~ 7.00 μm，9 號樣本值為(6.95±0.67) μm，與其他 5 份樣本差異顯著，1 號、3 號、4 號、7 號、10 號樣本之間差異不顯著。
▲packaging kiwipollen
3 討論與結論
本研究發(fā)現(xiàn)，15 份美味獼猴桃花粉離體培養(yǎng) 2 h后，供試樣本中 5 份雌株花粉均未長出花粉管，這與獼猴桃雌株花粉不育結論一致；10 份雄株花粉經離體培養(yǎng)后全部萌發(fā)，說明 10 份雄株花粉都具有可育性，但是不同雄株花粉的萌發(fā)率差異較大，萌發(fā)前后花粉形態(tài)也發(fā)生改變。相同培養(yǎng)時間內，8 號雄株花粉樣本的萌發(fā)率最高，在供試樣本中是最優(yōu)質的花粉，9 號樣本萌發(fā)率最低，二者間萌發(fā)率相差值為 56.42%。雄株花粉萌發(fā)活力過低，會嚴重影響實際生產中的授粉育種工作，導致減產和降低授粉成功率。 獼猴桃花粉萌發(fā)活力對授粉坐果起著關鍵作用，授粉之前需嚴格檢查花粉活力，挑選優(yōu)質高活力的雄株花粉進行授粉育種。
▲大基地專用的200克大包裝獼猴桃花粉
本試驗中的雌雄株花粉培養(yǎng)前后極面觀均為三裂圓形，但是赤道面觀形態(tài)差異較大。雌株花粉離體培養(yǎng)前后形態(tài)基本不發(fā)生改變，赤道面觀均為近球形；雄株花粉萌發(fā)前后的形態(tài)變化較大，萌發(fā)前為超長球形或長球形，萌發(fā)后為近球形，說明花粉形態(tài)學特征可作為獼猴桃種間資源材料的分類依據之一，該結果與鐘敏等的觀察結果一致。
▲Red kiwifruit
花粉萌發(fā)過程極其復雜，萌發(fā)前后10份雄株花粉的萌發(fā)溝寬度、極軸長度、赤道軸長度、P/E 值均發(fā)生變化，具體表現(xiàn)為萌發(fā)后的極軸長度幾乎都變小，赤道軸長度均變大，代表花粉形狀分級的 P/E 值變小，萌發(fā)溝寬度大幅度變寬，但是萌發(fā)后10份雄株花粉樣本的各項形態(tài)學指標彼此間差異不大，特別是 7號花粉樣本在萌發(fā)前的各項形態(tài)學方面的指標與其他 9 份樣本差異顯著，但是萌發(fā)后的差異均顯著較小，推斷可能是美味獼猴桃種間演化的結果，萌發(fā)前形態(tài)學上各自存在一定的差異，但是由于其攜帶的遺傳信息很相似，在萌發(fā)過程中受到相同調控，使不同美味獼猴桃花粉萌發(fā)后的形態(tài)學指標都趨于一個差異較小的范圍內，這利于授粉時雌花柱頭對不同美味獼猴桃雄花花粉的識別和兼容，從而增大授粉成功率。對花粉萌發(fā)前后形態(tài)變化的推斷及具體代謝調控機理有待進一步研究。
▲遵義市播宏獼猴桃果園有限公司是西南地區(qū)最大的獼猴桃果業(yè)公司，種植1200畝高山獼猴桃，是遵義市農業(yè)龍頭企業(yè)，市級先進扶貧企業(yè)。其中獼猴桃花粉項目是中國單體面積最大的獼猴桃花粉園，單個采粉園達到了400畝，豐產期產花粉400公斤，提供高品質、高倍體、高活性的獼猴桃花粉，可以滿足30000畝果園的花粉需要。聯(lián)系微信18030405084
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