摘 要：采用 RT-PCR 法從‘米良1號(hào)’獼猴桃中分離到1066 bp 的銅鋅超氧化物歧化酶分子伴侶蛋白基因 AdCCS1，登錄號(hào)為 KY471361。AdCCS1 的開(kāi)放閱讀框?yàn)?984 bp，編碼 327 個(gè)氨基酸，包含 3 個(gè)典型結(jié)構(gòu)域（N 端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和 C 端結(jié)構(gòu)域）和 2 個(gè)保守的金屬結(jié)合位點(diǎn)（MXCXXC 和 CXC）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示 AdCCS1 由 6 個(gè)外顯子和 5 個(gè)內(nèi)含子組成。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明 AdCCS1 聚在雙子葉植物分支中，與茶樹(shù) CsCCS 的親緣關(guān)系最近。此外，AdCCS1 的 5′端調(diào)控區(qū)存在多種光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)應(yīng)答元件。定量 PCR 分析顯示，AdCCS1 在獼猴桃葉片中的表達(dá)量最高，其次是成熟果、花、幼果和莖，在根中的表達(dá)量最低。獼猴桃果實(shí)中 AdCCS1 在 4 ℃低溫貯藏過(guò)程中的表達(dá)量均比 25 ℃貯藏中同期的低，說(shuō)明低溫抑制 AdCCS1 的表達(dá)。脫落酸和赤霉素處理后 AdCCS1 的表達(dá)下調(diào)，但二者的應(yīng)答模式不同。
▲獼猴桃果園幼果
關(guān)鍵詞：獼猴桃；AdCCS1；貯藏溫度；ABA；GA3；表達(dá)分析
銅是植物必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，通常作為細(xì)胞色素氧化酶、漆酶和銅鋅超氧化物歧化酶等的必需輔因子，參與生物體的電子傳遞和氧化還原等過(guò)程，在細(xì)胞的新陳代謝和植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用（Kim et al.，2008）。同時(shí)，銅是一種具有氧化還原活性的金屬，容易產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞具有毒害作用的活性氧（Ravet & Pilon，2012）。植物在演化過(guò)程中已發(fā)展了一套系統(tǒng)的銅代謝調(diào)控機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞中銅的吸收、分配和排出的精確控制，避免產(chǎn)生毒害。細(xì)胞內(nèi)銅的轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)節(jié)主要由銅分子伴侶蛋白實(shí)現(xiàn)。植物的銅分子伴侶蛋白是一個(gè)大家族，根據(jù)其具體功能分為 3 類。第 1 類是與酵母 ATX1 同源的 CCH 蛋白，負(fù)責(zé)銅的運(yùn)輸和活性氧清除（Himelblan et al.，1998）；第 2 類是與酵母 COX17 同源的 COX17 蛋白，負(fù)責(zé)將銅運(yùn)送到細(xì)胞色素氧化酶分子上以修復(fù)中斷的電子傳遞鏈（Balandin & Castresana，2002）；第 3 類是與酵母 Lys7 同源的 CCS 蛋白（Copper chaperone for Cu/Zn SOD，CCS），負(fù)責(zé)運(yùn)送銅給銅鋅超氧化物歧化酶，并激活其活性（Zhu et al.，2000）。
▲獼猴桃雄花蕾
銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase，Cu/Zn SOD）是植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)的重要抗氧化酶，但賦予 Cu/Zn SOD 活性的銅離子需由分子伴侶 CCS 提供（Forman & Fridovich，1973；Rae et al.，1999）。諸多研究表明 CCS 也參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)進(jìn)程。龍眼的 DlCCS 在體胚發(fā)生過(guò)程中差異表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄本隨著體胚的發(fā)育呈遞增趨勢(shì)，在成熟胚階段達(dá)到最高峰（林玉玲和賴鐘雄，2012）。巨尾桉的 EuCCS 在幼葉等生長(zhǎng)旺盛的組織中表達(dá)量較大，隨著葉片衰老，表達(dá)水平隨之下降（趙艷玲和姚婕，2017）。環(huán)境中過(guò)量的銅可以顯著上調(diào)大豆的 GmCCS 表達(dá)（Sagasti et al.，2014），而干旱脅迫明顯下調(diào)楊樹(shù)的 PtCCS 表達(dá)（Molina-Rueda et al.，2013）。香蕉的 MaCCS不僅參與對(duì)光、冷、熱和干旱等非生物脅迫的應(yīng)答，還受 ABA 和 IAA 等激素的誘導(dǎo)表達(dá)（Feng et al.，2016）。植物中 miRNA 可以通過(guò)降解靶基因轉(zhuǎn)錄本或抑制靶基因翻譯的方式在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。在擬南芥 miRNA 的研究中發(fā)現(xiàn)，miR398 介導(dǎo) AtCCS 基因 mRNA 的降解和翻譯，進(jìn)而影響 Cu/Zn SOD 的活性（Beauclair et al.，2010）。
▲播宏果業(yè)正在給獼猴桃授粉
近年，植物 CCS 基因已從番茄（Zhu et al.，2000）、馬鈴薯（Trindade et al.，2003）等多種植物中分離，但研究主要集中在結(jié)構(gòu)域功能、與 Cu/Zn SOD 的互作、逆境脅迫應(yīng)答等方面（Sagasti et al.，2011；姚婕和趙艷玲，2014)，對(duì)其在果實(shí)采后貯藏中的作用未見(jiàn)報(bào)道。獼猴桃（Actinidia chinensis）果實(shí)不耐貯藏（黃文俊和鐘彩虹，2017；梁春強(qiáng) 等，2017）。低溫貯藏可延緩其采后衰老，延長(zhǎng)貨架期（張美芳 等，2014；陳義挺 等，2017）。此外，脫落酸（ABA）等激素處理也會(huì)影響獼猴桃果實(shí)的軟化衰老進(jìn)程（陳昆松 等，1999；Kongsuwan et al.，2017；李樺 等，2017）。早期的研究表明，超氧化物歧化酶活性在獼猴桃采后貯藏中變化明顯（呂均良 等，1993；陳金印，2004），但其分子伴侶蛋白基因的表達(dá)情況未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究中以獼猴桃為材料，在克隆 AdCCS1 基因序列的基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼蛋白的特性、功能結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件和調(diào)控 miRNA 進(jìn)行分析，并研究其在不同組織部位、不同貯藏溫度和激素處理后的表達(dá)模式，為探索銅分子伴侶、超氧化物歧化酶與獼猴桃采后貯藏之間的關(guān)系提供新線索。
▲Kiwi Orchard Work
1 材料與方法
1.1 材料與處理
以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所獼猴桃種植基地的‘米良 1 號(hào)’獼猴桃（Actinidia chinensis var.deliciosa‘Miliang 1’）為供試材料，分別取根、莖、葉、花、幼果（花后 16 d）和成熟果（花后 160 d），用液氮速凍，保存于–80 ℃冰箱待用。
以 2017 年的成熟果（花后 160 d）為材料，選擇大小、可溶性固形物含量和硬度等相近的果實(shí)，待散去田間熱后，分別進(jìn)行 25 ℃貯藏處理（對(duì)照，取樣時(shí)間分別為貯藏 0、1、3、5、7、9、11 d）、4 ℃貯藏處理（取樣時(shí)間分別為貯藏 0、1、3、5、7、9、11 d）、50 mg · L-1 ABA 浸果 2 min 后 25 ℃貯藏處理（取樣時(shí)間分別為貯藏 0、1、3、5、7、9 d）和 50 mg · L-1 GA3 浸果 2 min 后 25 ℃貯藏處理（取樣時(shí)間分別為貯藏 0、1、3、5、7、9、11 d）。處理結(jié)束后用液氮速凍，并保存于–80 ℃冰箱待用。每樣品重復(fù) 3 次。
▲獼猴桃雄花展示
1.2 核酸的提取及 cDNA 合成
利用 TIANGEN 的 RNAprep Pure Plant Kit（北京）試劑盒提取成熟果的總 RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)法和 1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，質(zhì)量合格的總 RNA 采用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，USA）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，用于基因的克隆驗(yàn)證。采用 CTAB 法（Stewart & Via，1993）提取獼猴桃 DNA，用于基因組序列和 5′端調(diào)控序列克隆。
▲Picking kiwifruit flowers
1.3 引物設(shè)計(jì)與 PCR 擴(kuò)增
根據(jù)已公布的‘紅陽(yáng)’獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis‘Hongyang’）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為銅鋅超氧化物歧化酶伴侶蛋白基因的序列（編號(hào) Ach14g317331），設(shè)計(jì)引物 CCS-F（5′-AGAGAGTCACTACGCAGAGTC-3′）和 CCS-R（5′-CTCCAAACTCTATTGAGCAAGTAC-3′），擴(kuò)增‘米良 1 號(hào)’獼猴桃的 AdCCS1 及其基因組（genomic DNA，gDNA）序列。以‘紅陽(yáng)’獼猴桃基因組中 CCS 基因的起始密碼子（ATG）上游1 500 bp的gDNA序列為參考，設(shè)計(jì)上游引物CCSpro-F（5′-TGTGGTAATGCTGGAGTAACAAC-3′），并在 AdCCS1 起始密碼子（ATG）的下游設(shè)計(jì)特異的下游引物 CCSpro-R（5′-GGCGACGAAGATGAAG ATGAAG-3′），擴(kuò)增 AdCCS1 的 5′端調(diào)控序列。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 ~ 200 s，循環(huán) 35 次；72 ℃ 10 min。
▲yellow Kiwifruit
1.4 AdCCS1 的生物信息學(xué)分析
利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的 BLAST 功能分析 AdCCS1 與其他植物 CCS 基因的同源性。隨后采用在線
軟件 ExPASy、ProtComp v9.0、 NetPhos 2.0 、PredictProtein和 Swissmodel分別對(duì)獼猴桃 AdCCS1 編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位情況、葉綠體運(yùn)輸肽、磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用 ClustalX 軟件將 AdCCS1 的氨基酸序列與其他植物 CCS 序
列進(jìn)行多重比對(duì)。采用 psRNA Target在線軟件分析調(diào)控AdCCS1 的 miRNA，Expectation 閾值為 3.5，其他參數(shù)為默認(rèn)值。應(yīng)用 Mega 軟件的鄰位相連法（Neighbor-Joining）構(gòu)建獼猴桃與其他植物 CCS 的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用 Gene Structure Display Server在線工具繪制 AdCCS1 的基因結(jié)構(gòu)圖。根據(jù) PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 AdCCS1 5′端調(diào)控序列的順式作用元件。
▲紅心獼猴桃糖分檢測(cè)
1.5 AdCCS1 的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析
各樣品分別取 500 ng 總 RNA 作為模板，參照 TransScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal；TransGen，Beijing）說(shuō)明書合成第一鏈 cDNA。根據(jù)獲得的 AdCCS1 序列設(shè)計(jì)熒光定量引物 CCS-QF（5′-GGTGACCTGGGAACACTAAA-3′）和 CCS-QR（5′-TCACTTCCGTACAACGCTATG-3′）。以獼猴桃 Actin isoform B（ACTB）作為內(nèi)參基因（張慧
琴 等，2015），引物為 ACTB-QF（5′-GTGCTCAGTGGTGGTTCAA-3′）和 ACTB-QR（5′-GACGCTGTA TTTCCTCTCAG-3′）。在 Eppendorf 熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 30 s；94 ℃變性 5 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 10 s，40 個(gè)循環(huán)。PCR 循環(huán)結(jié)束立即進(jìn)行熔解，程序?yàn)?4 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，再升溫至 94 ℃保持 15 s。在 Eppendorf 的 Mastercycler? ep realplex 軟件中自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、熔解曲線和樣品 Ct 值。采用 2-??Ct 法計(jì)算 AdCCS1 在各樣品中的相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用 SPSS 軟件的 One-way ANOVA 分析基因表達(dá)量的差異顯著性，最后采用 Excel 繪制圖表。
▲redkiwifruit
2 結(jié)果與分析
2.1 AdCCS1 及其 gDNA 序列的克隆以‘米良1號(hào)’獼猴桃cDNA為模板，CCS-F和CCS-R 為引物，經(jīng) RT-PCR 擴(kuò)增得到 AdCCS1全長(zhǎng) 1 066 bp（圖 1，A），包含 1 個(gè) 984 bp 的完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼 327 個(gè)氨基酸。采用 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST 分析，結(jié)
果表明 AdCCS1 與茶樹(shù) CsCCS （Camellia sinensis ， KP337338 ）、葡萄 VvCCS （ Vitis vinifera，AFU52882）、龍眼 DlCCS（Dimocarpus longan，AKE81025）和大豆 GmCCS（Glycine max，AF329816）具有很高的同源性，相似性分別為 87%、81%、81%和 80%。AdCCS1 與‘紅陽(yáng)’獼猴桃同源基因 Ach14g317331 的核苷酸相似性為 94.75%，氨基酸相似性為 94.83%。
以 DNA 為模板，CCS-F 和 CCS-R 為引物，經(jīng) PCR 擴(kuò)增得到 AdCCS 的 gDNA 序列為 3 414 bp（圖 1，B）。將 AdCCS 及其 gDNA 序列提交 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為 KY471361 和 MG720543。
▲正在采摘獼猴桃雄花
2.2 AdCCS1 的生物信息學(xué)分析
2.2.1 AdCCS1 編碼蛋白的基本特征
采用 ExPASy 數(shù)據(jù)庫(kù)的 ProtParam 工具對(duì) AdCCS1 蛋白的分析結(jié)果顯示，AdCCS1 的分子量為34 583.21 D，等電點(diǎn)為 5.89，總親水性值為–0.059，不穩(wěn)定系數(shù)為 42.54，所帶正電氨基酸數(shù)與負(fù)電氨基酸數(shù)分別為 31 和 34，說(shuō)明 AdCCS1 是不穩(wěn)定的酸性蛋白，具有親水性。應(yīng)用 ProtComp v9.0預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示 AdCCS1 蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體的可能性最大，這與 ChloroP1.1分析顯示 AdCCS1 蛋白的 N 端具有一段 59 aa 的葉綠體運(yùn)輸肽相符。采用 NetPhos 3.1 軟件預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明 AdCCS1 多肽鏈上共存在 42 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中 31 個(gè)為絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，11 個(gè)為蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，不存在酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。PredictProtein 在線工具預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AdCCS1 還具有 1 個(gè) N 端糖基化位點(diǎn)，4 個(gè)蛋白激酶 C 磷酸化位點(diǎn)，5 個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，6 個(gè) N–?；稽c(diǎn)，1 個(gè)酰胺化位點(diǎn)和 1 個(gè)微體 C 端定位信號(hào)。對(duì) AdCCS1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，AdCCS1 中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，為 61.16%，其次是 β–折疊，占 29.36%，α–螺旋僅占 9.48%，這與其三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。
▲新西蘭的獼猴桃雄花園Kiwi Male Garden in New Zealand
進(jìn)一步采用 ClustalX 軟件將 AdCCS1 編碼的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，結(jié)果（圖 2）顯示所有比對(duì)序列都含有植物 CCS 的 3 個(gè)典型結(jié)構(gòu)域，即包含保守金屬結(jié)合位點(diǎn)MXCXXC 的 N 端結(jié)構(gòu)域、與銅鋅超氧化物歧化酶序列同源的中間結(jié)構(gòu)域和包含金屬結(jié)合位點(diǎn) CXC
的 C 端結(jié)構(gòu)域，這 3 個(gè)結(jié)構(gòu)域分別在銅離子獲取、識(shí)別銅鋅超氧化物歧化酶、并向銅鋅超氧化物歧化酶中插入銅離子進(jìn)而激活銅鋅超氧化物歧化酶中發(fā)揮作用（Schmidt et al.，2000；Lamb et al.，2001；Chu et al.，2005）。
▲氣動(dòng)獼猴桃授粉器
2.2.2 調(diào)控 AdCCS1 的 miRNA 預(yù)測(cè)與分析
采用在線工具 psRNA Target（Dai & Zhao，2011）和獼猴桃果實(shí) miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)調(diào)控 AdCCS1的 miRNA 進(jìn)行分析，結(jié)果表明，獼猴桃 AdCCS1 的表達(dá)受 miR398、miR398a-3p 和 miR166i-3p 的調(diào)控，其中 miR398 和 miR398a-3p 是通過(guò)裂解靶基因 mRNA 的方式調(diào)控 AdCCS1 的表達(dá)，而miR166i-3p 則是通過(guò)抑制靶基因翻譯的方式調(diào)控 AdCCS1 的表達(dá)。
2.2.3 AdCCS1 的系統(tǒng)進(jìn)化分析
為了分析獼猴桃 AdCCS1 的系統(tǒng)進(jìn)化情況，采用 Mega 軟件的鄰位相連計(jì)算法對(duì)獼猴桃和其他21 種植物的 CCS 蛋白序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖 3）顯示共分成兩大分支，蕨類植物門的卷柏SmCCS 和裸子植物門的北美云杉 PsCCS 聚在同一大分支，其他 20 種被子植物的 CCS 聚在另一大分支。其中被子植物分支又包含兩個(gè)小分支，分別為單子葉植物分支和雙子葉植物分支。AdCCS1聚在雙子葉植物分支中，與茶樹(shù) CsCCS 的親緣關(guān)系最近。可見(jiàn)，AdCCS1 與其他植物 CCS 一樣，具有明顯的種屬特征，在進(jìn)化上較為保守。
▲獼猴桃電動(dòng)授粉槍
2.3 AdCCS1 的基因結(jié)構(gòu)分析
采用 Gene Structure Display Server 工具構(gòu)建 AdCCS1 的基因結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果如圖 4 所示，AdCCS1由 6 個(gè)外顯子和 5 個(gè)內(nèi)含子組成。其中外顯子大小分別為 261、27、73、135、224 和 264 bp，內(nèi)含子大小分別為 450、180、119、1 130 和 469 bp。內(nèi)含子剪切位點(diǎn)分析結(jié)果表明，AdCCS1 的 5 個(gè)內(nèi)含子均在“GT-AG”處剪切，符合真核生物內(nèi)含子的剪接規(guī)律。
▲獼猴桃花粉電子顯微鏡下照片
2.4 AdCCS1 5′ 端調(diào)控序列的獲得及其特征分析
為了分析 AdCCS1 啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件，以 DNA 為模板，CCSpro-F 和 CCSpro-R 為引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到 AdCCS1 的 5′端調(diào)控序列，共 1 334 bp。將序列提交到 PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果如圖 5 所示，在起始密碼子 ATG 上游–268 ~–275 bp 處存在核心啟動(dòng)子元件TATA-box，在–226 ~–233 bp 和–238 ~–243 bp 處具有 CAAT-box。
除了具有典型的 TATA-box 和 CAAT-box 外，該序列包含的主要順式元件可歸類為 3 種：第 1種是光響應(yīng)應(yīng)答元件，分別是 ACE、Box-4、G-box、G-Box、Box-I、GA-motif、GAG-motif、GATA-motif和 chs-CMA2a；第 2 種是脅迫響應(yīng)應(yīng)答元件，包括厭氧應(yīng)答元件 ARE、熱脅迫應(yīng)答元件 HSE、響應(yīng)干旱的 MYB 結(jié)合位點(diǎn) MBS 及防御與脅迫應(yīng)答元件 TC-rich repeats；第 3 種是激素響應(yīng)應(yīng)答元件，包括脫落酸應(yīng)答元件 ABRE、乙烯響應(yīng)元件 ERE、赤霉素應(yīng)答元件 GARE-motif 及茉莉酸甲酯響應(yīng)元件 CGTCA-motif 和 TGACG-motif。此外，還含有 2 個(gè)生理節(jié)奏調(diào)控元件 circadian、2 個(gè)胚乳表達(dá)元件 Skn-1 motif、1 個(gè) AC-I 及 1 個(gè)與富含 AT 的 DNA 結(jié)合蛋白 ATBP-1 結(jié)合的元件。推測(cè) AdCCS的表達(dá)可能受光、非生物脅迫和激素調(diào)控。
▲Kiwi insect pollination
2.5 AdCCS1 的表達(dá)分析
AdCCS1 在所有被檢測(cè)的獼猴桃組織（根、莖、葉、花、幼果和成熟果）中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最低，葉片中的表達(dá)量最高，是根中的 13.6 倍，其次是成熟果、花、幼果和莖，分別是根中的 4.8 倍、4.2 倍、3.1 倍和 3.0 倍（圖 6）。
25 ℃貯藏的獼猴桃果實(shí)中 AdCCS1 的表達(dá)量在前 3 d 略有下降，從 5 d 開(kāi)始顯著上升，在 9 d時(shí)達(dá)到最大值（表達(dá)量是 0 d 的 5.58 倍），之后再次下降。4 ℃低溫貯藏的獼猴桃果實(shí)中 AdCCS1的表達(dá)量在前 5 d 顯著下調(diào)，7 d 時(shí)略有上升（表達(dá)量是 0 d 的 94%），之后再次下降，且均比 25 ℃貯藏中同時(shí)期的低（圖 7），說(shuō)明低溫抑制 AdCCS1 的表達(dá)。
不同激素處理后果實(shí)中 AdCCS1 的表達(dá)模式如圖 7 所示，在 ABA 處理后的 1 ~ 9 d 中 AdCCS1的表達(dá)量均顯著下降（P < 0.05）；在 GA3 處理后，AdCCS1 在 1、3 和 5 d 時(shí)表達(dá)量下降為 0 d 的 91%、48%和 56%，7 d 時(shí)上升至 0 d 的 90%，之后再次下降為 0 d 的 47%?？梢?jiàn)，獼猴桃 AdCCS1 對(duì)不同激素的應(yīng)答模式不同。ABA 和 GA3 處理后果實(shí)中 AdCCS1 的表達(dá)量在貯藏前 3 d 的下降幅度較同時(shí)期的 25 ℃貯藏中的下降幅度慢，且隨著貯藏時(shí)間的推移其表達(dá)量仍維持在較低水平，而 25 ℃貯藏中同時(shí)期的表達(dá)量顯著升高。
▲獼猴桃授粉
3 討論
本研究中獲得的獼猴桃 AdCCS1 基因編碼蛋白含有植物 CCS 的 3 個(gè)典型結(jié)構(gòu)域（N 端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和 C 端結(jié)構(gòu)域）和 2 個(gè)保守的金屬結(jié)合位點(diǎn)（MXCXXC 和 CXC），說(shuō)明 AdCCS1 與其他植物 CCS 一樣具有獲取銅、識(shí)別銅鋅超氧化物歧化酶并將銅插入到銅鋅超氧化物歧化酶活性位點(diǎn)進(jìn)而激活其活性的功能。不僅如此，AdCCS1 與已報(bào)道的植物 CCS 具有相同的基因結(jié)構(gòu)，即由 6 個(gè)外顯子和 5 個(gè)內(nèi)含子組成。雖然不同物種 CCS 基因的大小和內(nèi)含子長(zhǎng)度存在明顯差異，但 AdCCS1基因的第 3 個(gè)和第 4 個(gè)外顯子的長(zhǎng)度在進(jìn)化上高度保守，與香蕉、水稻、玉米、擬南芥、大豆、苜蓿和葡萄 CCS 基因中對(duì)應(yīng)外顯子的長(zhǎng)度一樣（Feng et al.，2016），分別為 73 和 125 bp。結(jié)合結(jié)構(gòu)域分析可知，第 3 個(gè)和第 4 個(gè)外顯子編碼蛋白正好包含 N 端結(jié)構(gòu)域，推測(cè)這 2 個(gè)外顯子長(zhǎng)度的高度保守與其結(jié)構(gòu)域?qū)︺~的精確調(diào)控有關(guān)。此外，屬于雙子葉植物綱的獼猴桃，其 AdCCS1 的第 5 個(gè)外顯子為 224 bp，這進(jìn)一步驗(yàn)證了 Feng 等（2016）的研究推斷，即植物 CCS 基因的第 5 個(gè)外顯子長(zhǎng)度僅在單子葉植物間（221 bp）或雙子葉植物間（224 bp）保守，可作為單、雙子葉植物 CCS 的典型特征。有意思的是，Wei 等（2018）對(duì)茶樹(shù)（Camellia sinensis）和獼猴桃全基因組進(jìn)化的分析結(jié)果表明，茶樹(shù)和獼猴桃是從大約 8 000 萬(wàn)年前的共同原始祖先中分化而來(lái)。本系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示 AdCCS1 聚在雙子葉植物分支，與茶樹(shù) CsCCS 的親緣關(guān)系最近，這與 Wei 等（2018）的研究結(jié)果相符?？梢?jiàn)，植物 CCS 在進(jìn)化上高度保守，并具有典型的種屬特征。
▲大型獼猴桃電動(dòng)鼓風(fēng)授粉機(jī)
雖然 AdCCS1 與其他植物 CCS 基因在結(jié)構(gòu)域、內(nèi)含子外顯子組成和系統(tǒng)進(jìn)化上高度保守，但在表達(dá)調(diào)控方面存在差異。AdCCS1 在獼猴桃葉片中的表達(dá)量最高，其次是成熟果、花、幼果和莖，在根部的表達(dá)量最低。而擬南芥 AtCCS 在花中高表達(dá)，在蓮座葉、莖和葉中低表達(dá)（Chu et al.，2005）。
馬鈴薯中則存在 2 個(gè) CCS 基因，其中 1 個(gè) CCS 基因僅在塊莖中表達(dá)，另一個(gè) CCS 基因在葉中表達(dá)（Trindade et al.，2003）。此外，Beauclair 等（2010）的研究表明擬南芥 AtCCS 的表達(dá)受 miR398 的調(diào)控，轉(zhuǎn)基因和序列突變證實(shí)擬南芥 miR398 是采用降解靶基因 mRNA 或抑制翻譯的方式對(duì) AtCCS表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控。本研究中對(duì)調(diào)控 AdCCS1 相關(guān) miRNA 的預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，AdCCS1 的表達(dá)不僅受miR398 和 miR398a-3p 的調(diào)控，還可能受 miR166i-3p 的調(diào)控，但這 3 個(gè) miRNA 對(duì) AdCCS1 表達(dá)的具體調(diào)控方式仍待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證?；虻膯?dòng)子區(qū)包含各種順式作用元件，是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要調(diào)控區(qū)（聶麗娜 等，2008）。本研究中分離到的 AdCCS1 的 5′端調(diào)控序列共 1 334 bp，包含多種順式元件，如 9 種光應(yīng)答元件、5 種激素響應(yīng)元件、4 種脅迫應(yīng)答元件和若干生理節(jié)奏調(diào)控元件circadian 等。而香蕉 MaCCS 基因啟動(dòng)子區(qū)含有 10 種光應(yīng)答元件（Sp1、I-box、G-box、G-Box、ACE、ATCT-motif、MRE、ATCC-motif、GAG-motif 和 GATA-motif）、5 種激素響應(yīng)元件（ABRE、motif IIb、CGTA-motif、TGACG-motif、TGA-element）和 5 種脅迫應(yīng)答元件（Box-W1、GC-motif、ARE、HSE及 TC-rich repeats）等（Feng et al.，2016）。不同物種 CCS 基因的表達(dá)模式差異可能與其啟動(dòng)子區(qū)順式元件的類型和數(shù)量不同有關(guān)。
▲凌晨起來(lái)采摘獼猴桃花蕾
SOD 酶活性與果實(shí)衰老密切相關(guān)，衰老越快的果實(shí)中自由基的產(chǎn)生量越多，其 SOD 活性也越強(qiáng)（呂均良 等，1993）。相對(duì)室溫貯藏，低溫貯藏可以有效延緩獼猴桃果實(shí)的采后衰老，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間（張美芳 等，2014）。陳金?。?004）對(duì)‘金魁’獼猴桃在 0 ℃低溫和室溫貯藏過(guò)程中 SOD酶活性變化研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí) SOD 活性在 0 ℃低溫貯藏過(guò)程中一直處于低水平，25 d 時(shí)才出現(xiàn)活性高峰（峰值為 10.96 U · g-1 FW），之后緩慢降回較低水平；而在室溫條件下貯藏，果實(shí) SOD 活性迅速升高，10 d 時(shí)就出現(xiàn)活性高峰（峰值為 20.60 U · g-1 FW），之后下降；說(shuō)明低溫可以推遲果實(shí) SOD活性高峰的出現(xiàn)，并降低酶活性。本研究中，獼猴桃果實(shí) AdCCS1 在 4 ℃低溫和 25 ℃常溫貯藏過(guò)程中呈現(xiàn)類似表達(dá)模式，即在整個(gè) 4 ℃低溫貯藏過(guò)程中 AdCCS1 的表達(dá)量均維持在較低水平，而在25 ℃常溫貯藏 5 d 開(kāi)始顯著上升，9 d 時(shí)達(dá)到峰值（表達(dá)量是 0 d 的 5.58 倍），之后迅速下降。相似的表達(dá)模式暗示AdCCS1可能通過(guò)影響SOD酶活性，參與獼猴桃果實(shí)在不同貯藏條件下的衰老進(jìn)程，進(jìn)而影響果實(shí)的貯藏性。此外，脫落酸和赤霉素處理可以下調(diào) AdCCS1 的表達(dá)，這可能與 AdCCS1啟動(dòng)子區(qū)存在脫落酸應(yīng)答元件 ABRE 和赤霉素應(yīng)答元件 GARE-motif 有關(guān)，但仍需進(jìn)一步通過(guò)啟動(dòng)子元件缺失等方法進(jìn)行驗(yàn)證。
綜上所述，獼猴桃 AdCCS1 具有植物 CCS 基因家族的基本特征，AdCCS1 在不同貯藏溫度和激素處理下差異表達(dá)，推測(cè) AdCCS1 可能參與調(diào)控果實(shí)貯藏過(guò)程中 SOD 酶活性，進(jìn)而影響果實(shí)的衰老進(jìn)程。
▲夏天的獼猴桃果園
Abstract：Copper/zinc superoxide dismutases（Cu/Zn SOD），acting as an essential antioxidant enzyme，play important roles in plant growth and development，stress response and fruit senescence，while their activities depended on the copper chaperone for Cu/Zn SOD（CCS）to delivering copper to them.
Therefore，CCS is also involved in the plant growth and development and stress response. In this study，a 1 066 bp gene of copper chaperone for Cu/Zn SOD（AdCCS1）was isolated from Actinidia chinensis var. deliciosa‘Miliang 1’by using reverse transcription（RT-PCR），and its accession number was KY471361. The AdCCS1 gene had an open reading frame of 984 bp and encoded 327 amino acids，which contained three typical domains（N-terminal domain，central domain and C-terminal domain）and two conserved metal binding sites（MXCXXC and CXC）. Gene structure analysis showed that AdCCS1 gene consisted of six extrons and five introns. Phylogenetic analysis revealed that AdCCS1 was clustered in the dicotyledonous branch with close relation to tea CsCCS. In addition，a variety of cis-acting elements associated with light response，stress response and hormone response were present in the 5′ terminal regulatory region of the AdCCS1 gene. Quantitative PCR analysis showed that AdCCS1 was expressed strongly in kiwifruit leaves，followed by ripe fruits，flowers，young fruits and stems，but weakly in roots.
The expression level of AdCCS1 in kiwifruits stored at 4 ℃ was lower than that of the same time stored at 25 ℃，which suggested that low temperature inhibit the expression of AdCCS1. The expression of AdCCS1 in fruits was down-regulated after being treated with abscisic acid and gibberellin，while their expression patterns were different.
Keywords：Actinidia chinensis；AdCCS1；storage temperature；ABA；GA3；expression analysis
▲獼猴桃蜜蜂授粉
評(píng)論